Molekulinė genetinė tyrimo metodas

Ištirti ir nustatyti variantus DNR naudojama struktūra molekulinės genetinės metodu. Kiekvienam DNR srities, kuri, tiriama šį chromosomų, geno arba alelio regioną, metodai skiriasi. Grindžiamas kiekvienas molekulinę genetinę būdas apima vieno ar kito manipuliavimo RNR ir DNR. Visi šie metodai yra būdingas didžiulis sudėtingumo, be laboratorinių sąlygų negali būti vykdoma, ir darbuotojai turi būti aukštos kvalifikacijos. Šis darbas atliekamas keliais etapais.

etapai

Pirma, RNR arba DNR mėginius, kad būti pagaminta. Čia, molekulinis genetinis metodas gali būti taikomas beveik bet kurios medžiagos: kraujo, leukocitų lašas, fibroblastų kultūrą, gleivinė (nuskustas), net plaukų folikulų, - DNR gali būti gaunami iš bet kurio mėginio. Jis tinka naudoti bet kokias molekulinius genetinius metodus ir jų įvairias galimybes ir jau seniai izoliuota DNR yra saugomi užšaldyti. Antrasis etapas yra skirta norimų fragmentų amplifikaoijos () DNR kaupimo, nes ji padeda užtikrinti polimerazės grandininę reakciją in vitro (in vitro nedalyvaujant gyvo organizmo). Kaip rezultatas, pasirinktus DNR fragmentų daugina pagal šio grandininę reakciją, ir DNR didėja pažodžiui milijonai kartų suma.

Trečiasis žingsnis molekulinių genetinių tyrimų metodų yra prielaida, Padaugintas restrikcijos (šio susiskaidymo, ašarojimas arba nupjauti). Apribojimas elektroforezės būdu atliekamas su poliakrilamido arba agarozės gelyje. Tai molekulinės genetinės metodas tiriant DNR fragmentą, leidžia kiekvienam imtis tam tikrą padėtį gelio. Po to, gelis yra gydomi etidžio bromido, galintis prisirišti prie DNR, švitinimo ultravioletinės šviesos šaltinis, tada jis yra galima stebėti liuminescencijos porcijomis. Molekuliniai genetiniai diagnostikos metodai yra įvairios ir gausios, bet pirmieji du etapai yra bendri visiems. Tačiau siekiant nustatyti DNR fragmentus, gelis gali būti spalvoti, ir daugelis kitų esamus metodus.

rūšis

Labiausiai tiesioginis ir plačiai metodai aptikimo mikobakterijų gali, apima aukščiau paminėtą molekulinę genetinė DNR mokymosi metodą. Jo esmė yra tai, kad, siekiant nustatyti skenavimo grandinės medžiagą konkrečių fragmentų DNR patogenų. Molekuliniai genetiniai diagnostikos metodai dar neturite efektyvesnį būdą, kaip atpažinti tokias ligas kaip tuberkuliozė. Naudojant polimerazės grandininė reakcija (PGR), galite būti tikri, kad originalus DNR padidins kopijų skaičių milijoną kartų, tai yra, bus stiprinimas, ir jis bus rodomas rezultatus. Jautrumo lygis yra labai aukštas - daugiau nei devyniasdešimt penkių procentų, kuris yra pagrindinis šio metodo privalumas.

Molekulinės-genetinių metodų tyrimus pagal derlingumą keliais egzemplioriais efektyvumo poilsio tiesiog dvigubai, nes šiuo atveju rengimas pavyzdys rodo konkretus Oligonukleotide seka padidėjo iki vieno šimto iki šešių kartų. Net kultūra diagnozė tuberkuliozės kvėpavimo sistemos žymiai sumažinti savo jautrumą. Tai kodėl šiuolaikinė medicina remiasi molekulinių genetinių metodų diagnozuojant tuberkuliozės. Aprašyti metodas yra veiksmingas, ypač kai susiduriame su ligų sukėlėjų aukštos antigeno kintamumo, nustatyti, kad kitas būdas yra daug sunkiau - reikia specialių maitinamosios terpės ir auginti ilgą laiką. Biocheminių ir molekuliniai genetiniai metodai gaminti labai skirtingą poveikį rezultatams.

tuberkuliozės diagnozė

Marshall PGR tuberkuliozės diagnozė dažniausiai naudojant šias DNR sekas, kurie yra būdingi visų keturių tipų ligos. Norint pasiekti šį tikslą, dažnai naudoja pradmenis, kad aptikti sekos elementai (IS-986, IS-6110), nes šie elementai apibūdina toli migruojančių rūšių Mycobacterium tuberculosis ir visada yra kelias kopijas į genomą. Taip pat DNR išskyrimas gali būti atliekamas iš grynų kultūrų ir klinikinės (skrepliai pacientų) bet kurio kito tinkamo metodu. Pavyzdžiui, ten strėlės būdas, kai lizės buferinis tirpalas yra naudojamas remiantis guanidino tiocianatą ir silicio dioksido nešikliu DNR. Pacientų, kurie skiriasi prastos bakteriologinio kasmet didėja, todėl klinikinėje praktikoje yra nustačiusi visiškai kitą lygį organizacijoje numeris: molekulinės genetinės metodas studijuojant DNR buvo vaidina svarbų vaidmenį diagnozuojant.

Tačiau turime pripažinti, kad tai ne be trūkumų. PGR metodas yra dažnai naudoja duoda labai daug klaidingų teigiamų rezultatų, ir priežastis yra ne tik techninės klaidos, bet ir pati metodo ypatybės. Be to, naudojant šią diagnozę metodą nustatyti mikobakterijų, kurios buvo identifikuotos gyvybingumą, tai tiesiog neįmanoma. Bet tai trūkumas yra ne pats svarbiausias. Molekulinės genetiniai metodai PGR diagnostikos reiškia, kad užteršimo mikobakterinė DNR riziką. Sertifikavimo reikalavimai dėl šios priežasties, kad PGR laboratorijose sukurtas išskirtinai sunku, jie reikalauja tris atskiras patalpas. PGR technologija yra moderni ir labai sudėtinga, tai reikalauja atitinkamos įrangos ir aukštos kvalifikacijos personalo panaudojimą.

bacterioscopy

Kai diagnozė analizės rezultatai turi būti palyginti su kitais duomenimis: klinikinio tyrimo, radiografijos, tepinėlio mikroskopija, pasėlių ir net atsako į konkretų gydymą, yra labai svarbus. Šioje serijoje, PGR tyrimai yra tik vienas iš komponentų. Aptikti ligos sukėlėją ankstyvoje diagnozė gali būti paprasčiausias ir greičiausias metodai - bakteriologiniai.

Yra naudojamas šviesos mikroskopu (dažymas Ziehl-Neelsen) ir fluorescentinis (dažančiosios liuminoforais). Privalumas yra tai, greitis tepinėlio rezultatais. Tačiau jos trūkumas yra teisingai laikomas ribotas pajėgumas dėl mažo jautrumo. Tačiau šis metodas yra pateiktas PSO rekomendaciją, kaip labiausiai ekonomiškas ir žemės aptikti tuberkuliozės pacientų. Aptikimo mikobakterijų bakteriologinio metodas prognozavimo vertę ir apskaičiuotą kiekybiškai bakterijų išsiskyrimą. Daug labiau pasitikintys elgtis su juo molekulinių genetinių tyrimų metodų tuberkulioze.

kultūrų

Geriau aptikimas mikobakterijų pripažinti kultūros studijas. Sėjos patologinę medžiagą jis yra pagamintas į kiaušinių vidutinės trukmės: Mordovsky, Finn II, LJ, ir pan. Gairės atsparumo mikobakterijų prie vaistų ir netiesioginių įrodymų, kad dėl mikobakterijų skaičius veiksmingumą ir jų kolonijų in vitro, jei taikyto metodo mokslinių tyrimų kultūra. Padidinti izoliacijos mikobakterijų inokuliacijos patologinių medžiagų kiekį, esantį vyks daugeliui aplinkose.

Susitikimas daugelio kultūros, patogenų, įskaitant dotacijos ir skysčių poreikius. Naudojamas šioje sistemoje ir automatizuota matavimo tipas VANTES augimas. Augalai turi būti surengti inkubacijos iki septynių iki aštuonių savaičių. Iki šio laiko pasėlių su augimo trūkumas gali būti laikomas neigiamu. Efektyviausias būdas aptikti Mycobacterium tuberculosis apsvarstyti biologinius mėginius Diagnostinė medžiaga užkrėsti jūrų kiaulytes, kurie labai jautrūs TB.

Kai skaičiai

Įdomu studijų sritis, kuri buvo atidaryta PGR diagnostikos buvo studijuoti M. tuberculosis - latentinės infekcijos. Modernus koncepcija TB infekcija rodo, kad iš šimto žmonių, kurie liečiasi su M. tuberculosis, devyniasdešimt gali būti užkrėstas, tačiau tik dešimt iš jų yra aktyvūs liga yra kuriama. Kiti turi TB imunitetą, ir todėl, kad devyniasdešimt procentų atvejų infekcija išlieka latentinis. Aptikti modelį ji padėjo molekulinė genetinė metodą.

Genetikai teigia, kad penkiasdešimt penki procentai tiems, kurių pasėliai patologinė medžiaga buvo neigiamas, ir aštuoniasdešimt procentų užsikrėtusių M. tuberculosis žmonių, bet teka be radiografijos apraiškų ligos, gavo PGR teigiami atsakymai. Tai genetinis diagnostikos metodas padėjo nustatyti pacientus, kuriems gresia PGR tyrimai, su savo analizėmis (mikroskopijos ir kultūra) rezultatai buvo neigiami, ir slaptasis infekcija M. tuberculosis buvo pateikti.

Šiuolaikiniai tyrimai

Rusijos Federacija ir bakteriologiniai laboratorijos naudoti skubos metodą absoliučių koncentracija: nitratų reduktazės aktyvumo išbandytų Griess reagento mikobakterijų. Anti-TB centrai naudoti metodą, kuris leidžia nustatyti atsparumą vaistams. Tai sėjos į skystoje terpėje, kur automatizuota Radiometrycznych ir fluorescencinė apskaitos sistemos mikobakterijų augimui. Tokia analizė atliekama greitai - iki dviejų savaičių.

Šiuo metu nauji metodai yra kuriami: atsparumas mikobakterijų narkotikų matuojamas tuo genotipo lygiu. Tyrimas molekulinius mechanizmus atsparumo genų ir parodo mikobakterijų buvimą. Šie genai yra susiję su atsparumu tam tikrų vaistų. Pavyzdžiui, kasa genų, Inha, katG atsparus izoniazido, rpoB geno - rifampicinas 16SP RNR genų ir rpsL - streptomicino, emb1 - į etambutolio, Gyra - fluorokvinolonas ir pan.

mutacijos

Modernus diagnozė žymiai padidino molekulinės genetinės lygio metodą studijuoja DNR ir leido vykdyti didelio masto studijas mutacijų visose jų spektrą. Dabar mes žinome, kad dažniausios mutacijos 516, 526 ir 531 kodonų rpoB genų, ir nustatė, kad atsparumą įvairių narkotikų. Yra visa eilė metodų mikobakterijų, naudojant ne tik tradicinius metodus rašyti - biocheminių, biologinių ir kultūrinių, bet taip pat plačiai naudojamos modernios molekulinės genetinės metodus. Jau yra tinkama ir pateikti teisingą diagnozę būdą už Monogeninis ligoms. Jie yra pagrįsti DNR tyrimų tiksliai plotas tam tikrą geną. Tai paprastai yra sudėtingas procesas, laiko ir brangu, tačiau duomenų, kad yra numatyta molekulinės genetinės analizės, yra daug tikslesnis ir informatyvus nei visų kitų analizuoja duomenis.

Jau seniai žinoma, kad DNR nesikeičia visą gyvenimą organizmo, kad jis bet kuriuo branduolius turinčioms ląstelėms odnakova ir tai leidžia imtis absoliučiai visų kūno ląstelių analizę, bet ontogenezy etape. Pažeistas genas gali būti nustatytas iki pirmųjų simptomų atsiradimo iki pilno masto klinikinių ligos, taip pat sveikų heterozigotinių žmonių, tačiau turintys mutacija geno. Molekuliniai genetiniai paveldima liga diagnostiniai metodai leidžia atskleisti savo (tiesioginis požiūris DNR diagnostika), taip pat analizuoti ligos segregaciją šeimos su žymeklis loci DNR (genetinės Polimorfizmas), kuris yra glaudžiai susijęs su pažeistu geno (ty netiesioginis požiūris DNR diagnostika). Tiesiogiai ar netiesiogiai - pateiktos DNR diagnostika remiasi nustatant griežtai apibrėžtą dalį žmogaus DNR metodus.

tiesioginiai metodai

Tiesioginiai metodai DNR diagnozės yra tada, kai kaltininkas genas paveldima liga yra žinoma, kaip gerai žinoma, ir tipų jos mutacijų. Pavyzdžiui, tinkama tiesioginiai metodai daugelio ligų. Tai Huntingtono chorėja (pratęsimas CTG-kartojasi), fenilketonurija (R408W), cistinės fibrozės (delF508, pagrindiniai mutacijas) ir pan. Pagrindinis privalumas tiesioginio metodas yra visiškai priklausanti diagnostikos tikslumą, ir nereikia daryti DNR analizę šeimos nariais. Jeigu atitinkamame geno mutacija rasta, tai leidžia tiksliai patvirtinti paveldimumo, genotipo nustatymo diagnozę už našta šeimos nariais.

Kitas tiesiogiai diagnozuoti privalumas yra laikomas nustatyti heterozigotines vežėjas blogų mutacijų iš giminių ir tėvų, kurie mirė nuo šios ligos. Tai ypač pasakytina apie ligos autosominiu recesyvinis. Trūkumai tiesioginių metodų, taip pat yra prieinama. Juos taikyti, reikia tiksliai žinoti, lokalizuoti nenormalus genų, Exon-INTRON struktūrą jos spektro ir jo mutacijos. Ne visi Monogeninis ligos Šiandien gavome tokią informaciją. Informatyvumą tiesioginiai metodai negali būti laikomas išsamiu, nes viena ir ta pati genų gali turėti daug patologinių mutacija, kuri sukelia paveldimų ligų.

netiesioginiai metodai

Netiesioginiai metodai DNR diagnostikos naudojami ne visi, kitais atvejais, jei pažeistas genas yra nenustatytas, tačiau tik chromosomų arba jei linija diagnozė nedavė rezultato (tai atsitinka, jei genų komplekso molekulinė organizacija ar didelė apimtis, jei yra daug patologinių mutacijas). Netiesioginiai metodai atliekami atskyrimo analizę polimorfines žymenų alelių šeima. Rasta toje pačioje chromosomų regione arba lokuso žymekliai yra glaudžiai susijęs su ligos ir atstovauja delecijas arba įterpimus, iešmų pakaitas, kartojasi, ir jų polimorfizmas yra dėl to, skirtingo dydžio nuo elementų bloko.

Patogiausia netiesioginių diagnozė laikoma mikrosatelitinių ir minisatellite polimorfizmas, kurie plačiai paplitę žmogaus genomo. jų vertė, išreikšta aukšto informacijos turinio, jei žala su genetine atstumo tarp persekiotoją ir geno yra ne per didelis. Pastaruoju atveju, įvertinimas tikslumas nustatomas į didele dalimi rekombinacijos dažnį tarp polimorfinės persekiotoją ir žalos. Netiesioginės diagnostikos metodai, taip pat teikti privalomą išankstinę žingsnį alelio dažnis analizuojamu gyventojų tyrimą tarp pacientų ir vežėjų mutacijų, plius Nustatant rekombinacijos Nepusiausvirųjų ir sukibimo žymekliai ir mutantas alelių tikimybę būtinumą.

kiti metodai

Trumpos segmentai DNR arba RNR, taip pat vieną geną vizualizuojami pagal mikroskopinio tyrimo dalis, negali būti, todėl, siekiant nustatyti mutacijas, kurių reikia molekulinės genetinės diagnozės. Yra "žmogaus genomo projektas", taip pat kitų pažanga molekulinės genetikos labai išplėtė paveldimų ligų diagnostikos galimybės - tiek prieš ir postnataliniam. Šie metodai gali suteikti anksti nustatyti ir padaryti prognozavimo polinesočiųjų ir Monogeninis ligas, kurio debiutas vyksta suaugus. Deja, dėl techninių galimybių molekulinių genetinių tyrimų kartais už etikos ribų, kurios yra nustatomas atsižvelgiant į paveldėjimo, ypač kai diagnozė yra paauglystėje ir vaikystėje.

Struktūriniai ir skaitiniai chromosomų anomalijos yra dažniausios priežastys ligos ir vėžys, ir daug apsigimimų. Chromosomų aberacijos, reikia nustatyti, kuri yra svarbi šeimos konsultavimas - įvertinti prognozę, kartu su reprodukcinės rizikos ateities nėštumo. Chromosomų analizė yra "aukso standartas" genetinę diagnozę, bet jis yra ribotas. Tik metodų molekulinės genetinės analizės galima padaryti daugiau, nes ten naudojami klonavimo technologija, pagrįsta liuminescencines etiketes, galinčių savo didelio jautrumo nustatyti subtilius chromosomų pokyčius, kurie yra neįmanoma aptikti klasikinio citogenetinius studijas. Šie metodai yra vis plečiame savo diagnostikos galimybes, kai tiriamas, vaikams su raidos negalia, protinis atsilikimas, su daugeliu kitų paveldimų ligų.

išvados

Labai svarbu žmonijai buvo geno struktūra bei funkcija žinių, rūšys kintamumo, gebėjimas aptikti paveldimas ligas, kurie įvyko ryšium su molekulinės genetikos plėtrai. jos metodai yra nukreipta į DNR molekulės tyrimo - ir kai tai yra normalu, ir kai ji yra sugadinta. Paruošimo deoksiribonukleorūgšties rūgščių sekų nukleotidų (DNR) tęsiasi etapais, nuo gavimo mėginius identifikuoti atskirus fragmentus. Izoliavimas genominės DNR iš ląstelių, apribojimas (nuplėšimą), amplifikacijos (klonavimo), elektroforezės iš fragmentų (atskiriant jų elektrinį krūvį ir molekulinę masę agarozės gelyje). Identifikavimo konkrečių fragmentų, esančių ant atskirą juostele paviršiaus.

Tada gauti į nusikalstamos veikos specialius filtrus, per kurią praeina kiekvieną fragmentas hibridizacija su klonuotų DNR fragmentų arba sintetinių radioaktyviųjų zondai yra kontrolė, kuri bus lygus kiekvieno mėginio. Jei pakeisite poziciją ar ilgis, palyginti su zondu, jei naujas fragmentas, arba dingo - visa tai rodo, kad analizuojami genas patyrė restruktūrizavimą nukleotidų seka. Yra aštuoni pagrindiniai būdai molekulinės genetinių tyrimų: sekos (nustatymas DNR sekos), polimerazės grandinės reakcija (padidėjimas sekų skaičius), pradmenų žinomi genų preparatas, DNR klonavimas, rekombinantinių molekulių baltymams Dėl nuolatinio rekombinantinių molekulių, sukurti pilną (kolekcija biblioteka) klonuotas fragmentus, kurie buvo gauti naudojant apribojimas.