Fluorescencijos mikroskopija: principai metodo

Absorbcijos ir iš naujo šviesos sklidimo tolesnių neorganinių ir organinių skysčių yra fosforescencija arba fluorescencijos rezultatas. Skirtumas tarp reiškinių yra tarp absorbcijos ir emisijos šviesos srauto intervalo trukmė. Kai atsiranda šių procesų fluorescencijos beveik tuo pačiu metu, o fosforescencija - su tam tikru uždelsimu.

istorinė informacija

1852, Didžiosios Britanijos mokslininkas Stokso, pirmą kartą aprašė fluorescenciją. Jis pristatė naują terminą kaip eksperimentų su rezultatas fluoritas, kurie išmeta raudoną šviesą ultravioletinėje šviesoje. Stokso pažymėti įdomų reiškinį. Jis nustatė, kad liuminescencinių spinduliuotės bangos ilgis yra visada didesnis nei sužadinimo šviesos srautą.

Norėdami patvirtinti 19 amžiuje hipotezę būta daug eksperimentų. Jie parodė, kad mėginių įvairovė švyti iš ultravioletinių spindulių poveikio. Tarp medžiagų, be kita ko, buvo kristalai, dervų, mineralinių medžiagų, chlorofilo, neapdorotos narkotikų, neorganinių junginių, vitaminų, alyvos. Tiesioginis naudojimas dažų biologiniams tyrimams prasidėjo tik 1930 metais,

Fluorescencijos mikroskopija: Aprašymas

Kai kurie iš medžiagų, naudojamų I pusmetį 20 amžiaus tyrimų eksponuojami labai specifiškai. стал важнейшим инструментом и в биомедицинских, и в биологических исследованиях. Ačiū veiklos, kuri negalėjo būti pasiektas kontrastingos metodus, fluorescencijos mikroskopijos metodas tapo svarbiausia priemonė biomedicinos ir biologinių tyrimų. Taip pat svarbūs rezultatai buvo gauti, ir medžiagų.

? Kokius privalumus fluorescencijos mikroskopijos metodą? Naudojant naujas medžiagas tapo įmanoma ir labai specifinis ląstelių submicroscopic komponentų parinkimas. Fluorescencijos mikroskopija gali aptikti vieno molekules. A dažų įvairovė leidžia kelių elementų identifikavimas vienu metu. Nepaisant difrakcijos ribos įranga, kuri, savo ruožtu, priklauso nuo konkrečių savybių mėginio ribotas erdvinis, molekulių žemiau šio lygio nustatymas taip pat yra gana įmanoma. Įvairių mėginiai po švitinimo parodų autofluorescenciją. Šis reiškinys yra plačiai naudojamas Petrology, botanika, puslaidininkių pramonėje.

Įranga

Studijuoti gyvūnų audinius arba ligų sukėlėjus, dažnai sudėtingas ar per silpnas arba labai stiprios nespecifinė autofluorescenciją. Tačiau tyrimais vertė įgyja įvadas į medžiagą komponentų džiaugiamės tuo tam tikro bangos ilgio ir skleidžiantis reikalingą šviesos srauto intensyvumą. Liuminoforų veikti kaip dažiklių, galinčių nepriklausomai pritvirtintomis struktūroms (matomų arba nematomos). Tokiu būdu jie turi aukštą selektyvumą į taikinį, ir kvantinė išeiga.

стала широко применяться с появлением естественных и синтетических красителей. Fluorescencijos mikroskopija buvo plačiai naudojamas nuo natūralių ir sintetinių dažiklių atėjimas. Jie turėjo tam tikrų intensyvumo profilius emisijos ir sužadinimo ir orientuojasi į konkrečius biologinių taikinių.

Identifikavimas, atskirų molekulių

Dažnai idealiomis sąlygomis, galite užsiregistruoti atskiras elementas švyti. Tai, be kita ko, būtina pateikti pakankamai žemą triukšmo detektoriaus ir optinio fone. Fluoresceino molekulė žlugti dėl fotobalinimui gali skleisti iki 300 tūkst. Fotonus. 20% surinkimo proceso efektyvumui ir gali įregistruoti juos į maždaug 60 tūkstančių suma.

, основанная на лавинных фотодиодах или электронном умножении, позволяла исследователям наблюдать поведение отдельных молекул на протяжении секунд, а в ряде случаев и минут. Fluorescencijos mikroskopija remiantis lavinų foto-diodų ar elektroninių daugyba, leido mokslininkams stebėti atskirų molekulių elgesį per sekundę, o kai kuriais atvejais net minučių.

sudėtingumas

Pagrindinis klausimas naudai optinio triukšmo fone slopinimo. Atsižvelgiant į tai, kad daugelis iš medžiagų, naudojamų filtrų ir lęšių būdingos tam autofluorescencija projektavimas, mokslininkų ankstyvosiose stadijose pastangos buvo orientuotos į komponentų, turinčių mažą fluorescenciją gamybai. Tačiau vėlesni eksperimentai paskatino naujų išvadų. , основанная на полном внутреннем отражении, позволяет достичь низкого фона и высокоинтенсивного возбуждающего светового потока. Visų pirma, buvo nustatyta, kad fluorescencijos mikroskopija, remiantis bendra vidinis atspindys, tai leidžia pasiekti mažą foną ir aukšto intensyvumo žadinimo šviesą.

mechanizmas

, основанной на полном внутреннем отражении, заключаются в использовании быстрозатухающей или нераспространяющейся волны. Fluorescencijos mikroskopijos principai, remiantis bendra vidinis atspindys yra išnyksta bangų ar išnyksta naudojimas. Tai įvyksta tarp žiniasklaidos sienos su skirtingais lūžio rodikliais. Šiuo atveju, šviesos spindulį eina per prizmę. Ji turi didelį lūžio rodiklio parametras.

Prizmė ribojasi su vandeniniu tirpalu arba stiklo su mažu parametru. Jei šviesos nukreipta į jį kampu, kad yra daugiau kritinė sijos, sija yra visiškai atsispindi nuo sąsają. Šis reiškinys, savo ruožtu, sukelia nonpropagating bangas. Kitaip tariant, generuotos elektromagnetinio lauko, kuris prasiskverbia į terpę, kurios apatinės lūžio indekso parametru per atstumą mažiau nei 200 nanometrų.

Išnyksta bangos intensyvumas šviesos pakaktų sužadinti fluoroforai. Tačiau, dėl savo labai nedidelį gylį, jo apimtis bus labai mažas. Rezultatas yra žemo lygio fone.

modifikacija

Fluorescencijos mikroskopija yra grindžiamas bendro vidaus atspindys, gali būti įgyvendintas su epi-apšvietimo. Tai reikalauja lęšius su aukštos skaitmenine apertūra (ne mažiau kaip 1,4, bet ji yra pageidautina, kad jis pasiekė 1.45-1.6), ir iš dalies apšviesta lauko aparatą. Pastarasis yra pasiekiamas nedidelė dėmelė dydžio. Didesnio vienodumo naudojant ploną žiedą, kuris yra užblokuotas pagal nuo sraute porcija. Dėl kritinės kampu, po kurio yra bendras atspindys, turime aukštą atspindėjimo panardinamasis terpę lęšio ir motyvacinį stiklo mikroskopu.